单克隆抗体制备技术和应用前景

单克隆抗体制备技术和应用前景

摘要:单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,其在基因和蛋白质的结构与功能研究方面有着不可或缺的作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠和噬菌体展示技术,核糖体展示技术及共价展示技术所产生的单克隆抗体,这些技术将有效解决大门克隆抗体的鼠源性问题。抗体的靶向性提供了一个改善治疗制剂选择性的方法,由于大部分抗原均可诱生抗体,因此抗体的应用的潜力是无限大的。本文综述了单克隆抗体的制备技术,包括嵌合抗体噬菌体展示技术核糖体展示技术基因工程抗体等,及其在临床医学和疾病的诊断与治疗等领域的广阔应用前景.

关键词:单克隆抗体;制备技术;应用前景.

前言

抗体是机体在抗原刺激下所产生的特异性球蛋白,又称为免疫球蛋白。20世纪50年代末期,电镜结果结合poler 和nisonoff 研究结果,建立了经典的免疫球蛋白单体的Y 结构模式,天然的抗体分子由4条他肽链组成对称结构,包括两条相同的重链和两条相同的轻链。天然抗体分子由4条肽链通过二硫键和其他分子间作用连接在一起,形成近似Y 形结构的两个臂为Fab 段,每个Fab 段由一个轻链和部分重链组成;剩下的部分重链称为Fc 段。根据氨基酸序列的高低,又可把重链和轻链分为可变区和生物学活性恒定区,可变区的互补结构区与抗体结合抗原的多样性有关,而恒定区的结构与抗体生物学活性有关。

1975年kohler 和Mistein 建立了杂交硫技术,将小鼠骨髓瘤细胞与产生绵羊红细胞抗体的小鼠脾细胞融合,形成的硫细胞既能产生抗体又能进行分裂繁殖,且产生的抗体只能识别一种抗原决定簇,称为单克隆抗体,单克隆抗体经历了鼠源性、人源性和全人化抗体三个阶段。迄今为止世界上已经研制出数以千计的单克隆抗体,并广泛应用于生物学、医学领域,在疾病发病的机制诊断和治疗方面发挥重要作用。本文从单克隆抗体的制备技术和临床应用方面进行综述。 1 单克隆抗体制备技术

1.1单克隆抗体流程

该技术主要包括免疫免疫动物、细胞融合和杂交瘤细胞的筛选三个环节。

1.1.1免疫动物 目前常用BALA/C小鼠,也可用SCID 小鼠(Severeconbinedimmumdeficiemy mice )、转基因小鼠、转染色体小鼠,用特定的外来抗原一次或多次免疫动物,刺激B 淋巴细胞增殖形成浆细胞、分泌针对该抗原的抗体。

1.1.2 细胞的融合 常用的骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞融合,通常采用PEG 法或PEG 电融合技术,该法稳定,安全简单;也有报道用小鼠的腘淋巴结细胞和骨髓瘤细胞融合,5周内成功产生抗病毒的小鼠单抗。

1.1.3 杂交瘤细胞筛选 HAT的选择培养基有3种关键成分:次黄嘌呤,甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷,A 是二氢叶酸还原酶抑制剂,可阻断核酸合成的主要途径。B 淋巴细胞可通过补救途径,由胸腺嘧啶激酶和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶利用T 和H 合成核酸,但不能在体外长期生存;骨髓瘤细,不能胞缺乏HGPRT 在该培养基中生长;杂交瘤细胞的双重特性,在HAT 培养基中长期生存又可产生抗体,成为制造单克隆抗体的细胞源。

杂交瘤技术所产生的抗体特异性高、纯度高,可大规模生产,但实验程序复杂且鼠源性单抗具有免疫原性,促使人体产生特异性抗体,引起过敏反应,另外在人体内半衰期比较短,常不能有效激活抗体,引起过敏反应和补体依赖的细胞毒反应。

1.2 基因工程抗体技术

1.2.1 嵌合抗体 将小鼠抗体的可变区基团与人免疫球蛋白恒定区基因重组,构建人/鼠嵌合重链、

轻链基团,在原核或真核细胞中表达。该抗体减少了鼠单抗的免疫原性,恒定区可有效发挥补体激活和与FC 受体结合的生物学活性。

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1.2.2 重构抗体

将编小鼠单抗决定簇互补区基因序列移植到编码人Ig 可变区的骨架区,构建新的抗

体。该方法与嵌合抗体相比,虽减少了人抗抗体反应,但仍然保持着鼠源性抗体的特异性。

1.2.3 小分子抗体

常用的小分子抗体有单链抗体、单域结构、双特异性抗体、免疫粘连素、催化抗体等。单链抗体由一段编码连接肽基因连接抗体的重轻链的可变区基因表达形成的重组蛋白;双特异性抗体是由氨基酸残基连接起来的两个不同小分子抗体,能够结合抗原,介导标记物与靶抗原的结合或某些效应因子定位于靶细胞;免疫粘结素是由Ig 恒定区基因连接人细胞受体或粘附分子基因,穿透力强、抗原性低、半衰期短,可在原核系统表达。易于进行基因工程的操作,因此受到广泛的重视。

1.2.4展示技术

1.2.4.1 噬菌体展示技术

噬菌体展示技术建在噬菌体外壳具有表达抗体蛋白片段能力的基础上。这项技术的基本原理是:用基因工程技术克隆人的抗可变区的全套基因中,然后将克隆基因插入噬菌体编码衣壳蛋白的基因中,建立噬菌体抗体文库。这样在噬菌体表面表达特定抗体片段,而在噬菌体核心DNA 中则含有该抗体片段的基因,噬菌体库包含达到1011中不同的噬菌体抗体。抗体的具体制备方法是将抗原包在固相介质上,加入带筛选的噬菌体颗粒与固定的抗原结合,获取结合的抗体,将未结合的抗体洗脱,从噬菌体库中筛选出针对特定抗原的特异性抗体的可变区。用表达有相应抗体分子的噬菌体颗粒去感染宿主菌,使该噬菌体颗粒得到扩增。将抗体可变区与恒定区组合得到具有完整功能的全人单克隆抗体。

噬菌体展示技术的最大优点是一旦噬菌体库建立后,就可以根据西药直接从文库中筛选得到针对目标抗原的特异性抗体,通常只需要23周的时间,大大缩短了单克隆抗体的制备周期。当抗体分离出来时。噬菌体系统同时也提供了设计抗体亲和力及应用的模式。但是该技术也存在一定的缺陷、由于受表达系统的限制,抗体库的库容不足以支持获得稀有的抗体,而且对噬菌体或表达宿主额生长或功能产生抑制作用的抗体也难以获得。

1.2.4.2 核糖体示技术

转基因小鼠和噬菌体展示技术均依赖于细胞技术和体内基因的表达,所建库的容量和分子多样性最终要受到转化效率、胞内环境等诸多因素的限制。因此,建立不受细胞转染和表达等因素影响的完全体外展示系统成为必然。新发展的核糖体战士和共价展示技术就属于无细胞转化技术,成功地解决了这些问题。

要建立体外蛋白质分子筛选系统,遗传分子必须附着在蛋白质分子上,并在蛋白质合成过程中结束时形成一种稳定的遗传分子-蛋白质复合体,才能保证筛选后的复制和扩增。利用蛋白质生物合成的主要场所核糖体作为基因型和表型相偶联的纽带,形成抗体-核糖体-mRNA 复合物是核糖体展示技术的基本原理。先扩增目的抗体基因DNA 文库,同时加入启动子、核糖体结合位点,转录形成MRNA 。在核糖体展示的系统中,MRNA 的终止密码子被除去,以防止转录的抗体蛋白被释放,使抗体始终与对应的MRNA 联系在一起。在无细胞翻译系统中孵育核糖体与MRNA 分子上移动组装肽链。在此过程中可以通过调节无细胞翻译系统的环境以确保抗体分子的正确折叠。核糖体展示系统的抗体筛选过程与噬菌体展示系统相类似。

核糖体展示技术的主要优点是一方面能够产生更大的抗体库,库容可达到1015,另一方面可以方便地与一些特殊的PCR 技术,如性别PCR 。错配PCR 等结合,获得更多的抗体遗传多样性,而且表达的抗体具有正确的空间折叠构象。核糖体展示技术已经成功地用于产生抗黄体酮的抗体片段。

1.3 RNA-多肽融合技术

利用核糖体展示技术在筛选过程中,由于核糖体是相对于分子量为2 000 000的大分子,而一个典型的肽库或抗体库中可供选择的分子大小一般都小于100 000。这样在核糖体大分子和被展示的小分子之间由于空间位阻可能会产生一些不可预知的变化,导致目标分子的丢失。有Phylos 公司开发的

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RNA-多肽融合技术基本克服了这一缺点。

RNA-多肽融合技术是将mRNA3’末端和抗体蛋白质的羧基端借助嘌呤毒素分子共价连接在一起。具体的方法是抗体库中DNA 转录出RNA 后,在mRNA 的3’末端共价连接一个嘌呤霉素标记的RNA 片段,作为合成的衔接物。在体外无细胞翻译系统中转录时,核糖体在RNA 分子上移动合成多肽。

2. 未来展望

单克隆抗体是未来治疗学上的一大研究热点,有报道称单克隆抗体药物将成为生物医药研究的主旋律。虽然单克隆抗体还存在一些问题,如需降低抗体的免疫原性,但随着噬菌体展示技术、核糖体展示技术以及RNA 体外展示技术的发展,单克隆抗体朝着全人化的方向发展,且制备时间大大缩短、成本大大降低。更有利于各种诊断试剂盒和各种疾病治疗药物的研制,因此我们相信单克隆抗体具有更广阔的前景。

参考文献

【1】翟中和,王喜忠,丁明孝. 细胞生物学. 北京. 高等教育出版社.2002

【2】吴庆余. 基础生命科学. 北京. 高等教育出版社.2002

【3】王俊丽,聂兴国生物制品学【M 】化学工艺出版社,2007:54

【4】马嵬娜. 单克隆抗体技术【J 】现代生物医学进展.2007 1911-1913


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