基因工程在生物制药技术中的应用

基因工程在生物制药技术中的应用

摘要

本文简述了基因工程在生物制药技术中的应用进展,主要对包括基因工程制药的流程,基因工程制药的技术手段,基因工程在药物生产中的应用,以及基因工程在新药开发中的应用等进行了介绍,随着对基因工程研究的不断深入,基因工程将会更多的应用在制药领域当中,并发挥不可替代的作用。

Application of biopharmaceutical in genetic engineering techniques

This thesis describes the techniques progress of application about the genetic engineering in the biopharmaceutical, introducting what contain the processes of genetic engineering pharmaceutical , the technical means of genetic engineering pharmaceutical, and application of genetic engineering in new drug development and so on. With the research on genetic engineering increasing. Genetic engineering will be more applicated in the pharmaceutical sector and play an irreplaceable role.

1.基因工程制药

基因工程制药是指按照人们的意图, 将外源基因整合入宿主基因组中, 表达具有生物学活性的蛋白药物。基因工程技术的迅速发展不仅使医学基础学科发生了革命性的变化, 也为医药工业发展开辟了广阔的前景, 以DNA重组技术为基础的基因工程技术改造和替代传统医

【】药工业技术已成为重要的发展方向1。

2.基因工程制药的流程

获得目的基因( DNA特定片段)→选择基因的合适运载体( 另一种DNA 分子) 组建重组质粒→( 将重组DNA 引入细菌或动植物细胞并使其增殖) 构建工程菌( 或细胞) → 培养工程菌→( 蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等) 产物分离纯化、除菌过滤→半成品检定→成品检定→包装。

3.基因工程制药的技术手段

3.1 PCR技术

【】聚合酶链式反应2是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术。该法由Mullis等人

于1985年发明, 并于1993年获得了诺贝尔化学奖。PCR 技术可分为定性PCR和定量PCR。定性PCR 技术包括: 反转录PCR (RT-PCR), 是从非常少量的mRNA样品构建大容量cDNA文库的方

【】法,还发展出实RT2PCR用于定量实验3;多重PCR(multiplex PCR),是指在同一PCR 反应体系

中加入多对不同的引物,以扩增同一模板的不同区域;反向PCR,该法可以对一个已知DNA片段

【】两侧的未知序列进行扩增和研究;锚定PCR,现称为cDNA末端快速扩增技术4。定量PCR技术

以实时PCR为代表, 其基本原理是在PCR反应体系中引入荧光标记分子,对每一反应时刻的荧光信号积累进行实时监测,计算出PCR产物量,或通过标准曲线法得出初始模板量。

3.2 基因芯片

基因芯片, 是生物芯片的一种, 其基本技术包括: 核酸方阵的构建、样品的制备、杂交和杂交图谱的检测及读出。根据用途不同可分为表达谱芯、测序芯片和诊断芯片。其中表达谱芯

【】片的应用最为广泛, 可用于基因功能分析、疾病发生机制的探讨及药物研究和筛选5。( 1)

确定药靶基因: 通过比较正常细胞与异常细胞表达谱之间的差异, 从而确定药靶基因。( 2) 监测药物治疗前后的基因表达变化:该监测可有3方面的作用。一是用于研究药物作用机制,

通过监测基因表达的变化, 可研究药物作用途径和对细胞信号转导的影响, 从而了解该药物的作用机制; 二是用于研究药物毒理, 从表达谱的改变和异常表达, 便可分析药物毒理; 三是用于药物筛选,利用用药前后表达谱的改变, 通过分析病理、生理、生化原理, 能高效地筛选出新的药物或先导化合物。

3.3 外源基因的表达

导入宿主细胞的外源基因, 通过基因表达得到相应的蛋白质产物。根据宿主细胞的不同可分为原核细胞表达系统和真核细胞表达系统。在外源基因表达时, 通常把一个报告蛋白的基因与一个目的蛋白的基因融合在一起, 形成融合蛋白, 用于目的蛋白的检测与纯化。常用的报告蛋白有B2半乳糖苷酶、谷胱甘肽S2转移酶、绿色荧光蛋白以及硫氧还蛋白等。其中值得一提的是GFP, 2008年8月有3位科学家因此获得诺贝尔化学奖: 日本科学家Osamu Shimomura、美国科学家Martin Chalfie、美籍华人科学家钱永健。除了直接标记目的蛋白用于检测与纯

【】化外, 还可利用某些GFP具有荧光共振能量转移的现象, 用于蛋白质折叠6、蛋白质2蛋白

【】【】质相互作用7、信号转导通路8等方面的研究。

3.4 基因工程分离大分子

基因大分子的分离主要指质粒和基因组DNA的分离。质粒分离的常用方法有碱变性抽提法、煮沸法、去污剂裂解法、质粒DNA释放法、酸酚法等。质粒在基因工程中最常用来做成各种克隆载体或表达载体。质粒载体还可用于RNA干扰的研究 (由于这一技术的研究和应用, 美国科学家Andrew Z. Fire博士和Craig C. Mello博士获得了2006年度的诺贝尔生理学或医学奖)。基因组DNA 的分离通常采用酚2氯仿法、基因文库、Southern杂交以及PCR扩增技术等。其中基因文库是指含有某种生物基因组不同基因片段的一群DNA 重组体克隆, 包括cDNA 文库和基因组DNA文库。最近又有研究者利用名为chum2RNA的小分子RNA 建立非PCR 扩增的单

【】细胞cDNA文库9。

4 基因工程在药物生产中的应用

4.1 重组表达生理活性物质

激素是由内分泌腺和特异细胞产生的含量极低的一类生物分子, 作为一类化学信使或信号分子引发专一的生理效应。激素在体内含量极少, 来源困难, 且具有种间特异性, 因此利用基因工程生产重组激素成为一种既安全又经济的策略。另外,利用基因工程技术不仅可以得到天然的激素蛋白, 还可以通过定点突变的方法有目的地改造蛋白的结构,获得性能更为

【】优越的或者是全新的激素药物10。

4.2 基因工程疫苗

基因工程疫苗是使用重组DNA技术克隆并表达保护性抗原基因, 利用表达的抗原产物活

【】重组体本身制成的疫苗。主要包括11 (1)基因工程亚单位疫苗: 将基因工程表达的蛋白抗

原纯化后制成的疫苗。 (2)基因工程载体疫苗: 利用微生物做载体, 将保护性抗原基因重组到微生物体中,使用能表达保护性抗原基因的重组微生物制成的疫苗。 (3)核酸疫苗: 使用能够表达抗原的基因本身制成的疫苗。 (4)基因缺失活疫苗: 通过分子生物学技术去除与毒力有关的基因获得的缺失突变毒株制成的疫苗。(5)蛋白质工程疫苗: 将抗原基因加以改造, 使之发生点突变、插入、缺失、构型改变, 甚至进行不同基因或部分结构域的人工组合, 以期达到增强其产物的免疫原性, 扩大反应谱, 去除有害作用或副反应的一类疫苗。

4.3 基因工程抗体

DNA重组技术与抗体基因结构功能的研究相结合,根据研究者的意图在基因水平对抗体分子进行分割、拼接或修饰, 甚至是人工全合成后导入受体细胞表达, 即产生新型基因工程

【】抗体, 主要应用于诊断试剂和治疗性抗体12。

基因工程抗体的改造包括以下途径(1)鼠单克隆抗体的人源化:克服鼠源抗体的免疫原

性, 使其和人体内的抗体分子具有及其相似的轮廓, 从而逃避人免疫系统的识别,避免诱导人抗鼠免疫反应。第一个可用人源基因代替的部分是鼠源抗体中的Fc区域, 用编码人抗体的Fc区域的DNA 片段替换鼠源单抗Fc 的DNA, 重组的DNA分子克隆到表达载体后转入培养的杂交瘤细胞,从该细胞中收集嵌合抗体。(2)制备双特异性抗体: 将天然的双价单特异性抗体分子进行改造, 把其他效应物质如毒素、酶、细胞因子、受体分子通过一定方法与抗体Fab片段连接,使之即可以与靶细胞结合,又可介导其他的效应功能, 从而最大限度的杀伤靶细胞;(3)制备完全人源性抗体:目前人们尝试将人源免疫干细胞导入缺失大部分免疫细胞的小鼠体内,使免疫细胞严重不足的小鼠实际上获得了人的细胞免疫系统, 当这种小鼠被抗原免疫的时候会产生人源的抗体;另一种途径是将改造过的人的抗体基因导入小鼠的胚胎系中,以得到能在免疫后产生人的抗体的转基因鼠。这种改造后的抗体除了构成抗原结合部位的轻重链各3个CDR 区域是鼠源外,其余都是人源的;(4)表达单链抗体: 完整的抗体分子,相对分子量较大,难以穿过血管壁,影响了靶部位对其的摄取。通过计算机分析, 如果一个单链抗体只包含VL和VH 区域,并加入一段衔接多肽将它们分开, 即可获得正确的抗原结合构像。人工合成一段DNA序列,然后以VL2衔接物2VH的顺序接上VL和VH 的DNA序列,这个嵌和基因结构在大肠杆菌中表达以后,纯化出的单链蛋白的亲和性和特异性都与原来完整的单克隆抗体没有差别。(5)制备抗体融合蛋白:将抗体的可变区域与非抗体蛋白融合,使融合蛋白继承抗体分子的结合特异性。或者用非免疫球蛋白的序列替换抗体的可变区, 例如,用CD4、白细胞介素2和肿瘤坏死因子受体等被称为/免疫黏附蛋白的分子的序列来替换,融合蛋白获得抗体相关的性质, 可激活机体免疫功能和提高药物动力活性等。

5 基因工程技术在新药开发中的应用

5.1 重组受体与药物筛选

在新药研究开发中日益广泛使用的受体筛选模型所需的受体往往来自动物体内,传统的受体制备是从大量的组织匀浆中提取,数量有限,因而不利于大量筛选。重组受体技术把受体或受体亚型的基因从人体组织中克隆出来,再在微生物或哺乳动物细胞内表达。与传统的受体制备技术相比,重组受体技术有很多优点:受体来源于人而不是动物,所以重组受体所得的试验结果与人体试验的结果直接相关;可大量制备受体并能得到只在特定组织中存在、用传统制备方法难以获得的受体;重组受体包含了细胞内或细胞膜上G2蛋白等信号转导系统,更接近人体的自然状态,重组受体纯度高,更为经济。它的出现,导致了制药工业从传统动物受体制备向克隆的人体受体的转变。

5.2 转基因动物与药物筛选

在医学研究中转基因动物可以真实地体现目的基因的活动特征,将分子水平、细胞水平、整体水平的研究有机地联系起来, 可在不破坏活体原有系统的前提下,对一个或多个因素进行研究, 使问题简化。利用转基因动物可建立敏感动物品系及人类相同疾病的动物模型用于药物筛选, 避免了传统的动物模型与人类某种症状相似的疾病在致病原因、机理不尽相同的缺点, 其结果准确,经济,试验次数少,大大缩短试验时间, 现已成为人们试图进行药物快速筛选的一种手段。目前,已经培育出较多的转基因动物用于药物筛选研究,并已在抗肿瘤药物、

【】抗艾滋病病毒药物、抗肝炎病毒药物、肾脏疾病药物的筛选中取得突破性进展13。

5.3 其它与药物筛选有关的基因工程技术

除了受体, 药物作用的靶酶也常用作药物筛选模型。这些酶在动物体内的含量通常也不高, 通过基因重组使其在微生物中大量表达也具有重要意义。例如,利用基因工程重组大肠肝菌来表达真核生物大鼠的DNA聚合酶B已获成功,为大量筛选DNA聚合酶抑制剂提供了充足的靶

【】酶14。

5.4 基因工程技术生产杂合抗生素

杂合抗生素定义为由遗传杂种产生的具有抗菌活性的新化合物, 区别于突变生物合成或杂

合生物合成所产生的已知抗生素的类似物。Hop2wood等15将放线紫红素生物合成基因转入另两种结构十分相似的异色满醌类代谢物曼德霉素(med2ermyc in)和二氢榴菌素的产生菌中表达, 获得了新的杂合抗生素meder2rhodin A和双氢榴紫红素。我国的王以光等将麦迪霉素产生菌的麦迪霉素4d酰化酶基因导入螺旋霉素产生菌并表达, 同样获得了异戊酰螺旋霉素。应用基因工程技术改造产生新的杂合抗生素, 为新药物开发提供了一种完全不同于以往的新技术。

6 展望

生物制药特别是基因工程制药已经是本世纪增长最快的行业, 因其治疗的有效性及安全性, 随着理论研究的深入, 分子生物学及基因组学的发展, 未来制药行业, 基因工程药物将占有越来越大的比重。目前, 世界各国都将基因工程及其逐渐加速的产业化进程视为国民经济的新增长点, 展开了激烈的市场竞争。欧美等生物技术先进国家有大批学者从事生物药品与基因产品研究与开发。

经过20 多年的发展, 我国基因工程制药已取得了可喜的成绩。然而, 我们应清醒的认识到我们与发达国家的差距, 如拥有自主知识产权的品种少, 多为仿制药品等问题。生物制药属于典型的高投入、高风险、高产出、长周期行业,这些特点造就了生物医药企业的发展不平衡。对于目前国内的生物医药企业来说, 竞争趋向于新技术与新领域, 因此具备创新能力、拓展融资渠道至关重要。基因工程制药的发展尚需业内各方共同努力, 具体如下:

(1) 产、学、研相结合, 以医药科研单位为核心, 高等医药院校和综合大学生命科学院及

药品生产企业共同参与研究与开发工作。

(2) 重点扶持优势品种, 对有创新及突破的品种政府应给于一定支持。

(3) 加大科研投入, 对分子生物学基因组学基础性研究予以资助, 在源头上对基因工程药

物的开发加大投入。

(4) 提高生物制品的检验能力, 完善科研服务平台, 为企业、院校的产品服务。

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