基因工程抗体研究进展及其临床应用

基因工程抗体研究进展及其临床应用

摘要:基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体,近年来随着生物工程技术的发展,许多基因工程抗体陆续问世,本文详细介绍了基因工程抗体的研究进展,概述了基因工程抗体在临床方面的明显优势和应用潜力。 关键词:基因工程抗体;研究进展;临床引用

Advances in Genetic Engineering Research and Clinical

Application of Antibody

Student majoring in Professional Veterinary Medicine Name DongChuanJun

Tutor Name MinLingJiang

Abstract:Genetic engineering antibody is the third generation antibody after polyclonal antibody and monoclonal antibody.In recent years,with the development of bio-engineering techniques,many genetically engineered antibodies have been presented to the public,and this article elaborates on research progress of the genetic engineering antibody,and its obvious advantages and potentials in clinical application.

Key words: Genetically engineered antibodies; Research; Clinical application.

引言 转基因技术迅速发展,其应用和发展的领域日益夸大。但转基因技术的弊端日益凸现,引起众多关注的目光。就转基因技术本身而言,社会各界对它的态度各有异同。不同的国家不同的民族和不同的个体对转基因技术的态度大相径庭。如何看待转基因技术?如何去应用和发展转基因技术?这些都是我们亟待解决的问题。

1 基因工程抗体介绍

1.1 基因工程简介

基因工程抗体是借助DNA重组和蛋白质工程技术,在基因水平对免疫球蛋白分子进行切割、拼接、修饰和重新组装的一种新型抗体。所制备的抗体去除或减少了可引起副作用的无关结构,但保留天然抗体的特异性和主要生物学活性,并可赋予抗体分子以新的生物学活性的总称【1】。

由于目前制备的抗体均为鼠源性临床应用时,对人是异种抗原,重复注射可使人产生抗鼠抗体,从而减弱或失去疗效,并增加了超敏反应的发生,因此,在 80 年代早期,人们开始利用基因工程制备抗体,以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能[2]。目前多采用人抗体的部分氨基酸序列代替某些鼠源性抗体的序列,经修饰制备基因工程抗体,称为第三代抗体[3]。 1.2 基因工程抗体种类

基因工程抗体主要包括嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、单链抗体、双特异性抗体等。

1.2.1 嵌合抗体

嵌合抗体(chimeric atibody)是最早制备成功的基因工程抗体。它是由鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因拼接为嵌合基因,然后插入载体,转染骨髓瘤组织表达的抗体分子【4】。因其减少了鼠源成分,从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应,并有助于提高疗效。

1.2.2 人源性抗体

是将人抗体的CDR代之以鼠源性单克隆抗体的CDR,由此形成的抗体,鼠源性只占极少,称为人源化抗体。

1.2.3 完全人源化抗体

采用基因敲除术将小鼠Ig基因敲除,代之以人Ig基因,然后用Ag免疫小鼠,再经杂交瘤技术即可产生大量完全人源化抗体。

1.2.4 单链抗体

是将Ig的H链和L链的V区基因相连,转染大肠杆菌表达的抗体分子,又

称单链FV(single chain fragment of variable region,sFv)。SFv穿透力强,易于进入局部组织发挥作用。

1.2.5 双特异性抗体

将识别效应细胞的抗体和识别靶细胞的抗体联结在一起,制成双功能性抗体,称为双特异性抗体。如由识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞(CTL细胞、NK细胞、LAK细胞)表面分子的抗体(CD3抗体或CD16抗体)制成的双特异性抗体,有利于免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用。

2 基因工程抗体的研究进展

2.1抗体工程的发展

最近,美FD强调:目前在临床试验中基因工程抗体约占生物制剂的30%。重组抗体的体积越来越小,或被重新构建成多价分子,或与其它分子相融合,如放射性核素、毒素、酶、脂质体和病毒【5】。重组技术的出现使筛选、人源化、抗体的生产得到革新,并取代杂交瘤技术,从而使以抗体为基础的药剂设计成为可能。

图1:抗体的发展

2.2目前基因工程抗体制备的主要方法 2.2.1人鼠嵌合抗体

主要是利用基因重组技术,把鼠抗体的重轻链可变区部分与人抗体重轻链恒定区的进行重组,减少鼠源结构,增加人源结构,而保持抗体与原抗原的特异性结合【6】。 1.首先把小鼠编码Ig重轻链的基因剔除。 2.制备表达人的Ig重轻链的转基因小鼠。

3.上二种小鼠回交,获得只表达人Ig重轻链的基因的小鼠。当用抗原免疫后,小鼠可产生完全人源抗体。

2.2.2 噬菌体抗体库技术

1.人的Ig重轻链可变区基因片段展示在噬菌体表面,组成抗体库。 2.过噬菌体把抗体的表型和基因型相偶联,易进行分子克隆和基因操作。 3.抗体库的来源影响筛选结果(免疫和正常人)。 4.高通量筛选与抗原结合的抗体,但亲和力低。 2.2.3 用人的骨髓瘤细胞直接制备全人抗体

由于骨髓瘤细胞稳定性高和融合率高,所以要建立好的人骨髓瘤细胞。 2.2.4 B细胞永生化技术

用EB病毒将人淋巴细胞永生化可产生分泌抗体的B细胞克隆【7】。这一技术较为成熟,但是存在抗体分泌不稳定的缺点,限制了其应用。或直接分离分泌抗体的B细胞,用PCR获得重轻连,构建全人抗体。 2.3抗体药物发展现状

1.FDA已批准上市的抗体药物。

2.SFDA(中国)已批准上市及临床研究的的抗体药物。 2.4工程抗体的未来发展与展望 2.4.1单克隆抗体的市场需求

图2:单抗体市场的预测与分析

2.2.2 噬菌体抗体库技术

1.人的Ig重轻链可变区基因片段展示在噬菌体表面,组成抗体库。

2.过噬菌体把抗体的表型和基因型相偶联,易进行分子克隆和基因操作。

3.抗体库的来源影响筛选结果(免疫和正常人)。

4.高通量筛选与抗原结合的抗体,但亲和力低。

2.2.3 用人的骨髓瘤细胞直接制备全人抗体

由于骨髓瘤细胞稳定性高和融合率高,所以要建立好的人骨髓瘤细胞。

2.2.4 B细胞永生化技术

用EB病毒将人淋巴细胞永生化可产生分泌抗体的B细胞克隆【7】。这一技术较为成熟,但是存在抗体分泌不稳定的缺点,限制了其应用。或直接分离分泌抗体的B细胞,用PCR获得重轻连,构建全人抗体。

2.3抗体药物发展现状

1.FDA已批准上市的抗体药物。

2.SFDA(中国)已批准上市及临床研究的的抗体药物。

2.4工程抗体的未来发展与展望

2.4.1单克隆抗体的市场需求

图2:单抗体市场的预测与分析

3.基因工程抗体药物的应用

随着生物工程技术的发展,许多基因工程抗体 陆续问世,并在医学领域的许多方面都具应用潜力,如病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病、同种异体移植物注射、哮喘、中风和青光眼治疗,尤其在诊断和治疗肿瘤性疾病及抗感染方面优势明显。

3.1基因工程抗体药物的临床应用

3.1.1 在肿瘤性疾病诊疗方面的应用

放射性标记抗体在肿瘤影像和治疗中很重要,并可有效进行药代动力学评估.以标记抗体注入人体内显示肿瘤部位抗原与抗体结合的放射浓集称放射免疫显像,由于基因工程抗体如单链抗体、Fab片段等分子量小、能很快清除、组织穿透力强,所以更适于放射免疫显像【8】。

恶性肿瘤的导向治疗,是通过重组技术将抗肿瘤相关抗原的抗体与多种分子融合,这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅助功能.这些分子包括:放射性核素、细胞毒药物、毒素、小肽、蛋白、酶和用于基因治疗的病毒.对肿瘤治疗来说,设计的双特异性抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原,并将细胞毒物质输送到肿瘤细胞.此外,抗体还可与携带药物的脂质体、各种PEG偶联,从而增强体内运输和药代动力学。作为免疫脂质体,转铁蛋白受体抗体可使药物通过血脑屏障到达大脑.抗体酶复合物作为前体药物也被用于基础肿瘤治疗。

3.1.2基因工程抗体的抗感染作用

预防和治疗感染性疾病常用的药物是疫苗和抗生素,但对于一些尚无有效预防及治疗手段的感染性疾病如 SARS、AIDS等,抗体治疗可做为首选方案。如在治疗AIDS方面,利用抗体工程技术已成 功地制备出HIV病毒整合菌的单链抗体ScAb2219,对HIV病毒感染的早期和晚期具有有效的抑制作用,并可望成为S基因治疗的有效手段。呼吸道合胞病毒 (RSV)易引起婴儿呼吸道疾病,如细支气管炎和肺炎,并可引起严重的并发症,目前已有人源化单克隆抗体Palivizumab经美国FDA批准上市,临床实验证明无毒、副反应,并可显著降低婴儿的住院率。我国率先建立了针对SARS的基因工程抗体库,这对于 SARS的预防、诊断和治疗都将起到重要作用和深远影响。对于中和其它病原分子,FDA已批准 Fab单体分子作为抗蛇毒药物;scFv片段和寡克隆复合物作为抗细菌毒素药物。

3.1.3 细胞内抗体

随着细胞信号转导和抗体工程技术的发展,诞生了细胞内抗体技术。这项技术是指在细胞内表达并被定位于亚细胞区室如胞核、胞浆或某些细胞器,与特定的靶分子作用从而发挥生物学功能的一类新的工程抗体。最典型的是 scFv,被称为内抗体。胞内抗体技术主要应用在抑制病毒复制特别是 HIV-1复制、肿瘤基因治疗方面,现已逐渐拓展到中枢神经系统疾病、移植排斥和自身免疫性疾病等领域。体外培养来源

于无关供体的角质形成细胞同种移植物用于严重的烧伤病人的治疗,往往会引起排斥反应,而MHCI类分子是引起移植排斥的重要抗原。Mhashikar等用编码抗 MHC I单链抗体的腺病毒转染角质形成细胞,结果显示明显降低了MHCI的表达,细胞内抗体介导的表型敲除是否有利于同种移植物的存活还需要进一步研究。

3.1.4 用于未来诊断的生物传感器和微矩阵技术

生物传感器和微阵列技术在不久以后将有可能成为主要的体外诊断技术.对于大量诊断试剂盒,抗体有高敏感性和高特异性.从最初的玻璃界面到现在的多种蛋白亲和界面,用于诊断的抗体微矩阵界面不断发展.随着体外机械人的出现,这一技术将进一步发展,并用于微生物污染、寄生虫和生物病原体的检测。

3.2基因工程抗体药物的应用领域

1.肿瘤导向治疗;

2.哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、红斑狼疮、急性心梗、脓毒症、多发性硬化症及其他自身免疫性疾病;

3.心脑血管疾病;

4.感染性疾病;

5.“生物导弹”

4.基因工程技术的发展方向

针对基因工程抗体药物的应用,明确基因工程技术的发展方向,从而让基因工程抗体对我们更有利[9]。

1.开发针对神经系统、肿瘤、心血管系统、艾滋病及免疫缺陷等重大疾病的多肽、蛋白质和核酸等新生物技术产品;

2.选择一批市场前景好的生物技术产品及疫苗、诊断用单克隆抗体,开发重点是乙肝基因疫苗与单克隆抗体诊断试剂等;

3.开发靶向药物主要是开发抗肿瘤药物。目前治疗肿瘤药物确实存在一个所谓"敌我不分"的问题。在杀死癌细胞的同时,也杀死正常细胞。导向治疗就是针对这个问题提出来。所谓导向治疗就是利用抗体寻找靶标,如导弹的导航器,把药物准确引入病灶,而不伤及其他组织和细胞;

4.人源化的单克隆抗体的研究开发。抗体可以对抗各种病原体,亦可作为导向器,但目前的单克隆抗体,多为鼠源抗体,其本身也被异种生物体视为抗原,当被注入人体后会诱导产生抗体或激发免疫反应。目前国外已研究噬菌体抗体技术,嵌合抗体技术,基因工程抗体技术以解决人源化抗体问题;

5.血液替代品的研究与开发仍然占重要地位。血液制品是采用大批混合的人体血浆制成的,由于人血难免被各种病原体所污染,如艾滋病病毒及乙肝病毒等,通过输血

而使接受输血的人感染艾滋病或乙型肝炎的案例时有发生,因此利用基因工程开发血液替代品引人注目。

基因工程抗体的进展已使抗体制备技术进入了一个全新时代,尤其药物抗体库的进展,解决了人源抗体的研制,促进了各种性能优良抗体以及具有多种功能的抗体融合蛋白的开发,可以预见基因工程抗体的研制正在进入一个新的高峰。但是抗体的亲和力减弱,与完整抗体结构相比,功能明显就会降低。人们对可能出现的新组合、新性状会不会影响人类健康和环境,还缺乏知识和经验,按目前的科学水平还不能完全精确的预测。所以我们要在抓住机遇,大力发展基因工程技术的同时,需要严格管理,充分重视转基因抗体的安全性【10】。

致谢:非常感谢闵令江老师在我大学的学习阶段教给自己基因工程这门学科。我从中学到了很多知识,认识了关于基因工程方面的一些问题,使自己从一无所知到现在基本认识了这门学科,在此我向老师表示我诚挚的谢意,感谢老师的诚挚教导。

【参考文献】

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[2]李庆军,董艳桐,施冰。植物抗虫基因的研究进展[J]。林业科技,2002,27(2):22 26。

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[5]Schi1lberg S., Fischer R., Emans N。Molecular farming of recombinant ant ibodies in plants[J].Cel 1 Mo1.Life Sci.2003, 60:433-445.

[6]Bouquin T.,Thomsen M.,Nie1sen L.K.,et

a 1.Human ant i— rhesus D IgG1 ant ibody produced in

transgenic plants[J].Transgenic Res.2002 ,

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[7]Wi seman G.A.,Leigh B., ErwinW.D., et a1.

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non—Hodgkin lymphoma.Cancer 2002, 94:1 349—1 357.

[8]沈孝宇。转基因之争[M]。北京:化学工业出版社,2008。

[9] 李彪;鼠-人嵌合抗体的研制及应用[J];国外医学。放射医学核医学分册;1996年04期。

[10] 黄华梁;基因工程抗体的研究[J];中国肿瘤生物治疗杂志。


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